ChIP-Seq检测注意事项
ChIP-Seq（染色质免疫沉淀测序）用于研究蛋白质（如转录因子、组蛋白修饰）与DNA的相互作用，其成功依赖于严格的实验设计、抗体质量及数据分析策略。
一、实验设计与样本准备
1.实验组别与生物学重复必需设置：实验组与对照组（如阴性IgG对照），每组至少3个生物学重复，减少个体差异导致的假阳性。
交联处理：细胞收集前需进行甲醛交联（固定蛋白-DNA复合物），交联时间需优化（通常5-15分钟），避免过度交联影响染色质片段化。
2.样本量要求细胞量：建议≥1×10⁷个细胞（金标准：320g离心后沉淀体积≥100μl）。
低丰度蛋白：若目标蛋白表达量低，需增加细胞量至5×10⁷以上。
二、抗体质量控制抗体选择与验证特异性要求：优先选择经过ChIP验证的抗体或标签抗体（如Flag、HA标签）。
验证步骤：WB验证：抗体需在WB中检测到单一清晰条带（仅约50%抗体满足此要求）。
IP-WB验证：初次实验需验证抗体在免疫沉淀中的特异性（避免非特异结合）。
IP-MS质控：正式实验前通过考马斯亮蓝（考染）或银染检测IP产物纯度。非特异性结合应对：阴性对照：使用同型IgG抗体作为对照，排除背景信号。数据库参考：查询权威抗体数据库（如Validated Antibody Database）。
三、免疫沉淀（IP）操作优化染色质片段化：
超声破碎：优化超声条件（如脉冲时间、功率），获得200-500 bp的染色质片段。酶切法：使用MNase处理可获得更均一的片段（适用于组蛋白修饰研究）。
IP送样建议：交联后处理：细胞交联后立即冻存（-80℃），避免反复冻融。预清除：加入Protein A/G磁珠预清除非特异结合，提高IP特异性。
四、数据分析与候选基因筛选数据质控与信号筛选非标定量信号：以LFQ强度（Label-Free Quantification）和差异倍数（Fold Change>10）作为强阳性筛选标准。背景过滤：去除常见污染蛋白（如核糖体蛋白、线粒体蛋白）。候选基因验证策略功能富集分析：结合文献和通路数据库（如KEGG、GO）筛选功能相关蛋白。互作网络分析：使用STRING数据库构建蛋白互作网络，聚焦核心节点蛋白（图1）。IP-WB验证：选择4-5个高置信度候选蛋白进行验证，
优先选择：差异倍数高（FC>10）且LFQ强度显著者；与目标蛋白功能匹配（如共调控同一通路）。
ChIP-Seq（染色质免疫沉淀测序）用于研究蛋白质（如转录因子、组蛋白修饰）与DNA的相互作用，其成功依赖于严格的实验设计、抗体质量及数据分析策略。
一、实验设计与样本准备
1.实验组别与生物学重复必需设置：实验组与对照组（如阴性IgG对照），每组至少3个生物学重复，减少个体差异导致的假阳性。
交联处理：细胞收集前需进行甲醛交联（固定蛋白-DNA复合物），交联时间需优化（通常5-15分钟），避免过度交联影响染色质片段化。
2.样本量要求细胞量：建议≥1×10⁷个细胞（金标准：320g离心后沉淀体积≥100μl）。
低丰度蛋白：若目标蛋白表达量低，需增加细胞量至5×10⁷以上。
二、抗体质量控制抗体选择与验证特异性要求：优先选择经过ChIP验证的抗体或标签抗体（如Flag、HA标签）。
验证步骤：WB验证：抗体需在WB中检测到单一清晰条带（仅约50%抗体满足此要求）。
IP-WB验证：初次实验需验证抗体在免疫沉淀中的特异性（避免非特异结合）。
IP-MS质控：正式实验前通过考马斯亮蓝（考染）或银染检测IP产物纯度。非特异性结合应对：阴性对照：使用同型IgG抗体作为对照，排除背景信号。数据库参考：查询权威抗体数据库（如Validated Antibody Database）。
三、免疫沉淀（IP）操作优化染色质片段化：
超声破碎：优化超声条件（如脉冲时间、功率），获得200-500 bp的染色质片段。酶切法：使用MNase处理可获得更均一的片段（适用于组蛋白修饰研究）。
IP送样建议：交联后处理：细胞交联后立即冻存（-80℃），避免反复冻融。预清除：加入Protein A/G磁珠预清除非特异结合，提高IP特异性。
四、数据分析与候选基因筛选数据质控与信号筛选非标定量信号：以LFQ强度（Label-Free Quantification）和差异倍数（Fold Change>10）作为强阳性筛选标准。背景过滤：去除常见污染蛋白（如核糖体蛋白、线粒体蛋白）。候选基因验证策略功能富集分析：结合文献和通路数据库（如KEGG、GO）筛选功能相关蛋白。互作网络分析：使用STRING数据库构建蛋白互作网络，聚焦核心节点蛋白（图1）。IP-WB验证：选择4-5个高置信度候选蛋白进行验证，
优先选择：差异倍数高（FC>10）且LFQ强度显著者；与目标蛋白功能匹配（如共调控同一通路）。
